Молекулярно-біологічні методи дослідження та їх використання

Молекулярно-біологічні методи дослідження відіграють велику роль у сучасній медицині, криміналістиці та біології. Завдяки досягненням в області вивчення ДНК і РНК, людина здатна вивчити геном організму, визначити збудника захворювання, розпізнати потрібну нуклеїнову кислоту в суміші кислот і т. д.

Молекулярно-біологічні методи дослідження. Що це таке?

Ще в 70-80-х роках вченим вперше вдалося розшифрувати геном людини. Ця подія дала поштовх розвитку генної інженерії та молекулярної біології. Вивчення властивостей ДНК і РНК призвело до того, що тепер можна використовувати ці нуклеїнові кислоти в цілях діагностики захворювання, вивчення генів.

Одержання ДНК і РНК

Молекулярно-біологічні методи діагностики вимагають наявності вихідного матеріалу: частіше це нуклеїнові кислоти. Існує кілька способів виділення цих речовин із клітин живих організмів. Кожен з них має свої переваги і недоліки, і це треба враховувати при виборі методу виділення нуклеїнових кислот в чистому вигляді. 1. Одержання ДНК по Мармур. Метод полягає в обробці суміші речовин спиртом, в результаті чого чистий ДНК випадає в осад. Мінусом цього способу є використання агресивних речовин: фенолу та хлороформу. 2. Виділення ДНК за Буму. Основна речовина, яка використовується тут, – це гуанідинів тиоционат (GuSCN). Воно сприяє осадженню дезоксирибонуклеїнової кислоти на спеціалізованих субстратах, з яких в подальшому можна зібрати за допомогою спеціального буфера. Однак GuSCN – це інгібітор ПТЦ, і навіть невелика його частина, яка потрапила в обложену ДНК, може вплинути на хід полімеразної ланцюгової реакції, яка відіграє важливу роль при роботі з нуклеїновими кислотами.


3. Осадження домішок. Метод відрізняється від попередніх тим, що осаджуються не самі молекули дехоксирибонуклеиновой кислоти, а домішки. Щоб це здійснити, використовують іонообмінники. Недолік в тому, що не всі речовини можуть осадиться. 4. Масовий скринінг. Використовується цей спосіб у тих випадках, коли не потрібні точні відомості про склад молекули ДНК, а необхідно отримати якісь статистичні дані. Пояснюється це тим, що структура нуклеїнової кислоти може пошкодитися при обробці детергентами, зокрема, лугами.

Класифікація методів дослідження

Всі молекулярно-біологічні методи дослідження поділяються на три великі групи: 1. Амплификационные (з використанням безлічі ферментів). Сюди відноситься ПЛР – полімеразна ланцюгова реакція, яка відіграє велику роль у багатьох з методів діагностики. 2. Неамплификационные. Ця група методів пов'язана безпосередньо з роботою сумішей нуклеїнових кислот. Прикладами є 3 види блоттингов, in situ гібридизація і т. д. 3. Методи, засновані на розпізнаванні сигналу від молекули зонда, який зв'язується з певною ДНК або РНК зонда. Приклад - система гібридизації в розчині Hybride Capture System (hc2).

Ферменти, які можуть використовуватися в молекулярно-біологічні методи дослідження

Багато методи молекулярної діагностики передбачають використання широкого діапазону ферментів. Нижче представлені застосовуються найбільш часто:
1. Рестриктаза – «ріже» молекулу ДНК на потрібні частини. 2. ДНК-полімераза – синтезує двухцепочечную молекулу дезоксирибонуклеїнової кислоти. 3. Зворотна транскриптаза (ревертаза) – використовується для синтезу ДНК на матриці РНК. 4. ДНК-лигаза – відповідає за утворення фосфодиэфирных зв'язків між нуклеотидами. 5. Экзонуклеаза – видаляє нуклеотиди з кінцевих ділянок молекули дезоксирибонуклеїнової кислоти.

ПЛР – основний спосіб ампліфікації ДНК

Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) активно використовується в сучасної молекулярної біології. Це метод, при якому з однієї молекули ДНК можна отримати величезну кількість копій (амплифицировать молекули). Основні функції ПЛР: - діагностика захворювань; - клонування ділянок ДНК, генів. Для проведення полімеразної ланцюгової реакції необхідні наступні елементи: вихідна молекула ДНК, термостабільна ДНК-полімераза (Taq або Pfu), дезоксирибонуклеотид-фосфати (джерела азотистих основ), праймери (2 праймера на 1 молекулу ДНК) і сама буферна система, в якій можливе проведення всіх реакцій. ПЛР складається з трьох етапів: денатурація, відпал праймерів та елонгація. 1. Денатурація. При температурі 94-95 градусів за Цельсієм походить розрив водневих зв'язків між двома ланцюгами ДНК, і в результаті ми отримуємо дві одноцепочечные молекули. 2. Віджиг праймерів. При температурі 50-60 градусів за Цельсієм відбувається приєднання праймерів на кінцях одноланцюгових молекул нуклеїнової кислоти за типом компліментарності. 3. Елонгація. При температурі 72 градусів відбувається синтез дочірніх дволанцюгових молекул дезоксирибонуклеїнової кислоти.

Секвенування ДНК

Молекулярно-біологічні методи дослідження часто вимагають знання послідовності нуклеотидів у молекулі дезоксирибонуклеїнової кислоти. Для визначення генетичного коду проводиться секвенування. Молекулярна діагностика майбутнього буде заснована на знаннях, отриманих при визначенні послідовності людини. Виділяють наступні види секвенування:

секвенування за Максаму-Гилберту;

секвенування за Сэнгеру;

пиросеквенирование;

нанопоровое секвенування.